【分析】微流控芯片上的多重尿路感染病原同步鉴定与抗生素敏感性测试

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注：文末有研究团队简介及本文科研思路分析

尿路感染是常见的感染性疾病，可以由多种细菌引起。尿路感染可引起局部和全身不适症状，严重者可导致肾功能衰竭，甚至感染性休克，因而需要及时诊断和治疗。尿路感染治疗需要了解病原菌的种类、数量以及对于抗生素的敏感性，因此要求细菌检测平台需具备多重病原菌快速定性与定量分析以及抗生素敏感性测试的功能。近日，广州医科大学附属广州市第一人民医院刘大渔团队发展了一种可以同步实现多重尿路感染病原鉴定与抗生素敏感性测试的纸基细胞培养阵列微流控芯片。

传统的尿路感染病原菌鉴定及抗生素敏感性试验（Antibiotic susceptibility testing，AST）主要采用平板培养法，但是耗时较长（一般需2 ~3天），不利于及时诊断和抗生素选择指导。近年发展起来的微流控芯片细菌分析技术较之传统方法具有很多优势。首先，芯片细菌分析平台小巧便携，操作简便，非常适合于现场快速检测；其次，芯片微分析平台有利于提高测试通量和降低试样消耗量，便于实现高通量分析；此外，大多数芯片细菌分析方法可以免去预增菌步骤，因而可以显著缩短分析时间。因此，微流控芯片技术为细菌分析提供了一种理想的解决方案。

在芯片上进行多重细菌分析与AST要求同步完成多重生化反应，因而需要解决包括多重试剂引入、多重反应的有效分隔以及多重检测指标的判定问题。针对上述问题，刘大渔研究组发展了一种PDMS/纸复合微流控芯片，在阵列芯片培养池中以滤纸作为衬底组合固定菌种特异性显色培养基和抗生素。借助芯片集成PVDF疏水薄膜止流阀，引入芯片的尿液样品被分隔于不同培养池以实现多重显色反应。借助于培养池阵列的空间分辨力和显色培养基的颜色分辨力实现多重细菌鉴定，通过实时显色强度分析实现细菌定量，依据抑制显色反应的最低抗生素浓度确定抗生素敏感性。以3种泌尿系统感染常见病原菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌）为模拟测试对象进行分析，结果表明芯片方法可以在18小时内实现对3种细菌的同步鉴定以及每种细菌对应的6种抗生素敏感性测试。对照实验显示，芯片法与传统方法细菌鉴定和抗生素敏感性测试结果一致性分别为94.1%和93.9%。

图1 用于多重尿路感染病原同步鉴定与抗生素敏感性测试的PDMS/纸复合微流控芯片结构示意图。芯片包含三层结构:顶层包含流体出入口以及排气孔，中间层含有一系列通孔及连接通道，底层无结构平板与中层封接后形成培养池，固定有抗生素及培养基的纸片置于培养池中。

图2 a连续监测不同浓度金黄色葡萄球菌(10³-10⁸ cfu/ mL)显色强度(左)，并绘制显色强度实时变化曲线（右）；b敏感、中介、耐药菌株的AST 结果:Ⅰ金黄色葡萄球菌;Ⅱ粪肠球菌;Ⅲ大肠杆菌。图中纵向符号对应抗生素水平:L低浓度抗生素、M中浓度抗生素、H高浓度抗生素，横向字母对应抗生素种类和敏感情况(R耐药；I中介；S敏感)。

本研究建立的微流控芯片细菌分析方法具有分析装置小巧、操作简便快速的特点和优势，非常适合于医疗资源匮乏条件下的细菌分析。

这一成果近期发表在《Analytical Chemistry》上，文章的第一作者是广州医科大学附属市一人民医院徐邦牢和广州医科大学检验系研究生杜燕。

该论文作者为：Banglao Xu, Yan Du, Jinqiong Lin, Mingyue Qi, Bowen Shu, Xiaoxia Wen, Guangtie Liang, Bin Chen, Dayu Liu

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

Simultaneous Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing of Multiple Uropathogens on a Microfluidic Chip with Paper-Supported Cell Culture Arrays

Anal. Chem., 2016, 88, 11593-11600, DOI: 10.1021/acs.analchem.6b03052

刘大渔博士简介

刘大渔研究员，临床医学学士，病理学硕士、分析化学博士。，博士后期间于香港科技大学机械工程系微机电工程实验室从事微分析系统研究，现任广州医科大学附属市一人民医院检验医学研究室负责人。目前工作为基于微流控芯片的检验医学应用研究，内容包括：1.现场快速诊断技术；2.微生物鉴定和药物敏感性测试技术；以及3.肿瘤细胞-微环境相互作用研究。迄今已经发表SCI收录研究论文40余篇，研究工作发表于Anal. Chem.、Lab Chip等专业杂志，申请专利20余项。

科研思路分析

Q：这项研究的想法是怎么产生的？

A：多重病原的快速联合检测是临床医学迫切需要的技术。研究组在前期工作中进行了微流控芯片上多重细菌鉴定的初步探索，在此基础上本研究将多重细菌鉴定与抗生素敏感性测试结合。这种复合式分析要求同步完成多重生化反应，因而需要解决包括多重试剂的引入、多重反应的有效分隔以及多重检测指标的判定问题。针对上述问题，本研究发展了一种微流控芯片纸基细菌分析方法，在芯片培养池中以滤纸作为衬底组合固定菌种特异性显色培养基和抗生素。滤纸成分为纤维素，具有疏松多孔结构，不仅具有良好的生物相容性，而且易于固定试剂。借助于芯片集成PVDF疏水薄膜止流阀，引入芯片的尿液样品被分隔于不同培养池，以实现多重显色反应。根据特异性显色结果实现细菌定性鉴定，通过实时显色强度分析实现细菌定量测定，依据抑制显色反应的最低抗生素浓度确定抗生素敏感性，因此在芯片上实现了多重细菌的同时定性与定量分析和AST。本方法简便快速，尤其适于医疗资源匮乏条件下的细菌快速分析。

Q：在研究中过程中遇到的最大挑战在哪里？

A：本项研究中最大的挑战是芯片细菌测试系统上的功能集成。芯片细菌测试系统需要完成进样、细菌培养、定性分析、定量分析以及细菌抗生素敏感性实验，保证这些功能在同一芯片上的实现是实验的一个关键问题。为有效地实现上述功能，需要结合芯片以及配套控制系统的结构和功能设计。为实现芯片细菌测试系统上的功能集成，首先要确保每个单元功能的实现，包括构建随机分散体系和适宜的细菌生长环境、用于细菌鉴定的多重显色反应以及结果的获取和判读。

Q：本项研究成果最有可能的重要应用有哪些？

 A：本研究发展的微流控芯片多重细菌鉴定和AST方法，具有操作简便、耗时短、低消耗和高通量的优势，尤其适合于在医疗资源有限的条件下（例如门诊、急诊和基层医疗单位）使用。我们的后续研究工作将进一步扩展检测对象范围，将这种纸芯片数字化测试发展成通用型病原细菌检测方法。